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技术宝典— ELISA
BioTNT ELISA 03 ------ 实验准备及注意事项

ELISA实验的事前准备工作一

 

1.         确定有进行ELISA实验最重要的仪器:

酶标仪;

 

2.         确定实验动物种属和ELISA检测指标:

查找文献,根据临床意义,确定要用的实验动物种属(如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猪、狗等)和用ELISA方法检测的实验指标(如白介素,生长因子,激素等);

 

3.         确定要搜集的标本类型:

如血清、抗凝血浆、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液、关节华液、组织匀浆、细胞培养上清液等;

 

4.         确定要收集的标本数量:

用以确认需要采购检测试剂盒的数量;

 

5.         确定标本的处理方法:

根据所采购的检测试剂盒说明书,确定不同类型标本的正确处理方法;

 

6.         确定要收集的标本体积;

合理分组,根据实验模型,确定要收集的标本体积;

 

7.         确定购买试剂盒的厂家和试剂盒类别:

根据适用于要检测的标本的相应规格的ELISA试剂盒的灵敏度、检测范围、价格和到货期等情况来确定检测试剂盒的品牌厂家和类别;

 

8.         确定要购买的试剂盒的规格和数量:

根据标本数量,确定要购买的试剂盒的规格和数量,同时了解试剂盒的整盒有效期和拆开包装後的有效期(各主要成分的开瓶有效期),降低实验风险;

 

9.         确认实验复孔:

为了增加结果的可靠性,对标准曲线和标本,要求做双复孔或者三复孔,就是同一份标本,平行做两次或者三次。如果本身试剂盒的稳定性好,而又不要求每个数据的绝对准确,主要目的是为了统计学意义的话,可以选择做双复孔或者是单孔。

 

10.     确定时间的合理安排:

最主要确定标本的采集时间,根据采集时间来安排标本的保存条件、何时进行试剂盒的购买、如何进行预实验的安排、如何进行大批量标本的检测:如果标本采集时间过长,如超过六个月,请把标本放在-70度或者液氮罐中保存;在基本上收集完标本的前一个月,进行试剂订购。一般国外试剂的到货期最长一个月,有足够的时间来等待试剂盒的来到。到货後,取几个样品(最少两个,估计的低值和高值)和标准品来进行预实验。预实验成功後才能进行大批量标本的实验。

 

注:因为每个试剂盒可能都经过长途运输,运输途中可能会导致试剂盒失效,所以预实验是必不可少的,这样才能保证试剂盒没有问题,而且一旦有问题可以快速得到解决,且不用浪费自己辛苦收集的标本。

 

 

ELISA实验的事前准备工作二

 

确认ELISA实验需要但试剂盒中未提供的材料:

 

1.       可在试剂盒要求得波长处进行读数的酶标仪;

2.       水浴箱或者是恒温箱(空气浴);

3.       能精确吸取10-200µL的移液器;

4.       可调多道(8)移液器(50200µL);

5.       供可调多道移液器使用的试剂存放槽;

6.       洗瓶或洗板机;

7.       蒸馏水或去离子水;

8.       1升的圆柱形量筒;

9.       移液器:1和(1025 mL);

10.   移液器枪头;

11.   纸巾;

12.   计时器,用以监控温育步骤;

13.   处理池和消毒剂(例如:0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水);

 

 

其中需要注意的是:

 

1.       在实验进行前,需要确认酶标仪在恰当波长能够正常读数,且能正常打印;

2.       用一支温度计来测量使用的温育设备(水浴箱或者是恒温箱),温控是否精确;因为随着仪器的老化,上面的控温不一定准确,所以需要测量一下实际温度;

3.       对移液器,也就是加样器进行校正;确保加样准确。

 

 

ELISA实验的进行(预实验):

 

1.       仔细阅读试剂盒的说明书和注意事项;

2.       这一阶段对加样要求不高,主要是熟悉整个操作,验证试剂盒,明确标本是否可以检测出来。

3.       相信做过一次预实验以后,即使是从来没有做过ELISA实验的人,也会信心大增的。

4.       根据预实验反馈的几种结果来确定是进入下一步:大批量实验,还是重新进行预实验。只有预实验结果是好的,成功的时候,才能进入下一步。

 

 

预实验反馈的几种结果:

 

I.           预实验结果:

定量检测中,如果标准曲线正常,标本值落在最高点和最低点之间,则认为预实验结果是好的,成功的。

 

II.          不好的预实验结果:

A.         定量检测中,标准品如果不显色,请查看自己的操作是否有问题;若非操作问题,则有可能是标准品失效,请与厂家联系,是再做一次,还是返回厂家由厂家来解决;

B.         定量检测中,标准品正常显色,但标本没有显色;这时有两种情况:

1.         标本中某些指标含量很低,会出现这种情况;可以通过修改某些操作步骤来达到提高灵敏度;或者通过超滤的方法来浓缩标本,可以使标本能检测出;也可以通过更换更灵敏的试剂盒来达到这个目的。

2.         动物品系问题导致,要检测的指标与试剂盒中包被的抗体不同,可能会导致检测不出。

 

 

ELISA实验的进行(大批量标本的实验):

 

与预实验不同的是,正式实验增加了对加样的要求,要求加样迅速、准确。

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