GST pull-down就是将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶与之孵育,从而捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离,最后经western blot 或质谱分析,从而证实两种蛋白间的相互作用。
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实验目的
1、体外验证两种目标蛋白质是否直接互作
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2、截短形式表达验证互作结构域
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3、结合MS 技术筛选与诱饵蛋白互作未知蛋白分子
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实验分组
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实验步骤
(1) 加样:取1.5ml EP 管,加入 GST 融合蛋白 (对照组用 GST 蛋白) 5µg,
检测是否与 GST 融合蛋白结合的另一蛋白 5µg,20-50µl GST 琼脂糖磁珠,补充 GST-Pull down buffer 到总体积 500µl 左右。
(2) 结合:4 ℃结合 4~8 hr 或过夜,配合磁力架收集磁珠,去上清。
(3) 漂洗:加入500-1000 µl GST-Pull down buffer 洗涤 beads。配合磁力架收集磁珠,去上清
(4)重复洗涤 3 次 (依结合强度和背景情况增加或者减少洗涤次数) 。
(5) 收集磁珠,去上清,加入 60-80 µl 1×SDS上样缓冲液 或者2×SDS上样缓冲液,沸水浴 10 min,样品冻存于-20 ℃。
(6) Westernblotting 检测另一个蛋白。
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相关试剂
GST-pulldown buffer:
20 mM Tris-HCl (pH 7.5);
100 mM NaCl
1 mM MgCl2
10 mM Na2EDTA
10 ug/ml BSA
0.5% NP-40
Note: adding 1 mM PMSF,cocktail,20mM NEM immediately before use.
常用原核表达载体:
pGEX4T-1
pET28a
GST pull-down 实验优点
1、可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。
2、GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强,洗脱纯度高
GST pull-down 实验缺点
1、验证互作是在试管中进行的生化反应,不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。
2、融合表达的 GST 标签,肽链较长,可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。
GST pull-down 与 Co-IP 区别
1、GSTpull-down 是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果,只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明;
2、Co-IP 实验是细胞内高表达目的蛋白,并通过 IgG 球珠-抗体-蛋白复合物体系,分离出互作的蛋白复合物,是细胞内的体内反应结合。