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—磁珠、琼脂糖珠和IP试剂盒
GST pull-down就是这么简单!

  GST pull-down就是将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种诱饵蛋白,目的蛋白溶与之孵育,从而捕获与之相互作用的捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离,最后经western blot 或质谱分析,从而证实两种蛋白间的相互作用。

实验目的

 

1、体外验证两种目标蛋白质是否直接互作

 

2、截短形式表达验证互作结构域

 

3、结合MS 技术筛选与诱饵蛋白互作未知蛋白分子

 

 

 

实验分组

 

实验步骤

1) 加样:取1.5ml EP 管,加入 GST 融合蛋白 (对照组用 GST 蛋白) 5µg

检测是否与 GST 融合蛋白结合的另一蛋白 5µg20-50µl  GST 琼脂糖磁珠,补充 GST-Pull down buffer 到总体积 500µl 左右。

2) 结合:4 ℃结合 48 hr 或过夜,配合磁力架收集磁珠,去上清。

3) 漂洗:加入500-1000 µl GST-Pull down buffer 洗涤 beads。配合磁力架收集磁珠,去上清

4)重复洗涤 3 (依结合强度和背景情况增加或者减少洗涤次数)

5) 收集磁珠,去上清,加入 60-80 µl 1×SDS上样缓冲液 或者2×SDS上样缓冲液,沸水浴 10 min,样品冻存于-20 ℃。

6 Westernblotting 检测另一个蛋白。

相关试剂

GST-pulldown buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

100 mM NaCl

1 mM MgCl2

10 mM Na2EDTA

10 ug/ml BSA

0.5% NP-40

Note: adding 1 mM PMSFcocktail20mM NEM immediately before use.

常用原核表达载体:

pGEX4T-1

pET28a

 

GST pull-down 实验优点

1、可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。

2GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强,洗脱纯度高

GST pull-down 实验缺点

1、验证互作是在试管中进行的生化反应,不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。

2、融合表达的 GST 标签,肽链较长,可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

GST pull-down  Co-IP 区别

1GSTpull-down 是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果,只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明;

 

2Co-IP 实验是细胞内高表达目的蛋白,并通过 IgG 球珠-抗体-蛋白复合物体系,分离出互作的蛋白复合物,是细胞内的体内反应结合。

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