GST pull-down就是将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶与之孵育，从而捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot 或质谱分析，从而证实两种蛋白间的相互作用。

实验目的

1、体外验证两种目标蛋白质是否直接互作

2、截短形式表达验证互作结构域

3、结合MS 技术筛选与诱饵蛋白互作未知蛋白分子

实验分组

实验步骤

（1） 加样：取1.5ml EP 管，加入 GST 融合蛋白 (对照组用 GST 蛋白) 5µg，

检测是否与 GST 融合蛋白结合的另一蛋白 5µg，20-50µl  GST 琼脂糖磁珠，补充 GST-Pull down buffer 到总体积 500µl 左右。

（2） 结合：4 ℃结合 4～8 hr 或过夜，配合磁力架收集磁珠，去上清。

（3） 漂洗：加入500-1000 µl GST-Pull down buffer 洗涤 beads。配合磁力架收集磁珠，去上清

（4）重复洗涤 3 次 (依结合强度和背景情况增加或者减少洗涤次数) 。

（5） 收集磁珠，去上清，加入 60-80 µl 1×SDS上样缓冲液 或者2×SDS上样缓冲液，沸水浴 10 min，样品冻存于-20 ℃。

（6） Westernblotting 检测另一个蛋白。

相关试剂

GST-pulldown buffer：

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)；

100 mM NaCl

1 mM MgCl2

10 mM Na2EDTA

10 ug/ml BSA

0.5% NP-40

Note: adding 1 mM PMSF，cocktail，20mM NEM immediately before use.

常用原核表达载体：

pGEX4T-1

pET28a

GST pull-down 实验优点

1、可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。

2、GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高

GST pull-down 实验缺点

1、验证互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。

2、融合表达的 GST 标签，肽链较长，可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

GST pull-down 与 Co-IP 区别

1、GSTpull-down 是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果，只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明；

2、Co-IP 实验是细胞内高表达目的蛋白，并通过 IgG 球珠-抗体-蛋白复合物体系，分离出互作的蛋白复合物，是细胞内的体内反应结合。