BioTNT 甲基化检测技术服务

      DNA突变会导致表型改变。然而，序列不变化，基因调控照样能发生，这就是表观遗传学的威力。DNA甲基化是表观遗传学中的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育中起着重要作用，也与多种癌症密切相关。

  脊椎动物的DNA甲基化通常发生在CpG岛中的胞嘧啶。CpG岛是CpG二核苷富集区域，GC含量大于50%，长约200-500 bp。甲基化是由DNA甲基转移酶所催化的，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（5mC）。这样一个简单的生化反应却有着意想不到的严重后果。许多重要的过程如胚胎发育和细胞周期调控都与甲基化息息相关，而多个癌症也表现出异常的甲基化模式。甲基化的存在就像一个开关，在不需要基因表达的时候将基因的活性关闭；去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

5-羟甲基胞嘧啶5-hydroxymethylcytosine（5-hmc）的分子式是C5H7N3O2，是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)的羟基化形式，5-羟甲基胞嘧啶是TET家族的酶通过氧化5-甲基胞嘧啶（5-mC）产生的，被称为“第六种碱基”，可以调控基因表达的关闭，是一种重要的表观遗传修饰，可能与去甲基化过程有关，5-羟甲基胞嘧啶的具体作用机制还不明确。

甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。

由于普遍认为DNA甲基化在多种疾病尤其是癌症中扮演着重要的角色，所以人们对表观遗传学研究寄予厚望，希望能从中发现新的诊断和治疗的生物标志物。

DNA甲基化研究有以下两大类实验路线，BioTNT 对此进行了以下比较：

第一类： 不进行亚硫酸盐处理，对样本进行酶切；

实验方法：采用样本抽提DNA 后，应用位点特异的甲基化酶和非甲基化酶进行样本的剪切，避免了亚硫酸盐处理；

后期采用QPCR 方式，对CPG 岛进行定量检测；

可以得到甲基化和非甲基化的含量比例；主要适用于少量样本，多位点的检测；

运用不同试剂盒，通过后期实时 PCR 数据用于确定 5-羟甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的数量。结果显示了所选组织中 5-羟甲基胞嘧啶水平的变化。

代表产品： Qiagen 甲基化PCR Array；

NEB 5-hmc 和5-mc 定量检测；

Biotnt 提供您进行甲基化CPG 岛甲基化含量和非甲基化含量检测的技术服务；

收费情况如下：

1. 样本抽提和处理费用，300元/样本；

2.单个CPG 岛，费用为150元/八孔双复数据；

新方法推荐：

不进行亚硫酸盐处理，对样本进行酶切，采用样本抽提DNA 后，应用位点特异的甲基化酶和 非甲基化酶进行样本的剪切，避免了亚硫酸盐处理；

后期采用QPCR 方式，对CPG 岛进行定量检测；

可以得到甲基化和非甲基化的含量比例；主要适用于少量样本，多位点的检测；

第一种方法，运用不同试剂盒，通过前期不同酶的处理，以及后期实时 PCR 数据用于确定 5-羟甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的数量。结果显示了所选组织中 5-羟甲基胞嘧啶水平的变化。

第一种：限制性酶切产物+QPCR 分析甲基化和非甲基化水平：

推荐一：采用Qiagen  EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (12)试剂盒，可以通过准备您的基因组DNA 样本，进行后期的QPCR；

使用试剂盒中提供的消化液，进行4种消化；methylation-sensitive restriction enzyme (Enzyme A)，消化的是甲基化位点；methylation-dependent restriction enzyme (Enzyme B) 消化的是非甲基化的DNA 序列；

推荐二：采用Biotnt 甲基化DNA 限制性酶切试剂盒，可以通过准备您的基因组DNA样本, 进行后期的QPCR；

通过检测（M0， Mu, Mm，Mum）的CT 值，可以计算出M% 和U%。

第二种：独特方法！

可以同时检测5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）和 5-甲基胞嘧啶（5-mC）的实验方法：

采用5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒，能对特定 DNA 位点内的 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）和 5-甲基胞嘧啶（5-mC）进行定性及定量。这种酶学方法包括三步简单操作，利用了同裂酶 MspI 和 HpaII 对甲基化敏感性的不同。

简述三步操作如下：基因组 DNA 用 T4 噬菌体β-葡糖基转移酶和 UDP-葡萄糖处理,将所有的 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）糖基化；用限制性内切酶 MspI 和 HpaII 消化 DNA，这两个同裂酶有不同的甲基化敏感性；然后用终点或实时 PCR 来定性和定量不同的甲基化状态。试剂盒的设计目的是简化甲基化分析,增加发现新生物靶标的可能性。

特性

 定量分析基因座内的5-hmC 和5-mC，重复性好

 简单明了的实验步骤

 与现有 PCR 技术相兼容

 可用于高通量用户

用 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒分析 Balb/C 小鼠组织样品（基因座 12）不同的甲基化状态。A）用于甲基化分析的 6 个不同反应的终点 PCR。虚线框中的泳道显示了 5-羟甲基胞嘧啶的存在。B）实时 PCR 数据用于确定 5-羟甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的数量。结果显示了所选组织中 5-羟甲基胞嘧啶水平的 

实验方法和实验步骤：

1. 抽提DNA试剂盒;

2. 5-hmc 和5-mc 的处理试剂盒, 原理: 同一份样本分成三份, 按照说明, 5-hmc 可进行糖基化; 甲基化敏感的限制性内切酶进行剪切;甲基化不敏感的限制性内切酶进行剪切; 经过这个步骤,后期样本进行QPCR 检测 ; 每个样本处理费用为300元；8个样本起做；

1个CPG 岛实验费用为1500元 8个样本；

实验步骤:

1.  样本的基因组DNA 抽提;

2.  1份样本分成三份,进行不同的酶切处理;

3.  您要检测的基因CPG 岛查询; 1个CPG 岛 设计一对引物, 每份样本进行QPCR双重复扩增; 

4. 正式实验: 每个样本,抽提,酶切处理,1个CPG 岛的QPCR, 为样本分为四份的实验方法, 双重复实验(共8孔);样本前期试剂费用为300元/样；1个CPG 岛的检测费用为150元/样本；同一份样本，要增加一个CPG 岛，每个样本增加150元/样本；

实验结果显示方式:

样本

5-hmc 含量百分比;

5-mc 含量百分比;

UM(未甲基化)含量百分比;

第二类：亚硫酸盐处理后进行后期的检测分析：

样本的采集和稳定，基因组DNA 纯化，亚硫酸氢盐转化及CpG位点的甲基化检测。

后期检测分为：

1.  亚硫酸盐测序；

2.  MSP（甲基化PCR）检测；

3.  高清溶解曲线

2.1    亚硫酸盐测序：

实验步骤：

l  基因组DNA的提取；

l  BSP实验亚硫酸盐处理及纯化（QIAGEN，cat：59824）

l  引物的设计（加粗斜体下划线部分为引物位置,红色字体区域为检测区域）PCR产物

l  PCR扩增；反应程序

l  T/A克隆与测序：PCR产物纯化，连接T载体，转化酶切法鉴定阳性菌落，挑取质粒送测序（10个克隆）；

l  实验结果：

1. DNA 质量鉴定，Nano 数据，

2. DNA 完整性电泳图片；

3.PCR 产物电泳图片；

4.测序分析结果：

2.2    特异位点的甲基化PCR（MSP）

   2.1采用基因组DNA 提取试剂盒，抽提基因组DNA；

2.2采用硫化处理试剂盒：epigentek，对样本进行硫化处理 ；

2.3 后期采用QPCR 方式或者电泳方式进行产物的检测；

甲基化特异性PCR(MS-PCR)

 这种方法经济实用，是目前应用为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR 或者MS-real time PCR。MSP方法中，通常设计 两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。MS- Real time PCR与上面的原理相同，设计的引物，进行real time PCR 检测，通过CT值，扩增曲线和溶解曲线进行实验结果的判断；

如果样本中同时存在甲基化 和非甲基化的DNA 模版，则通过CT 值 和Delta CT 值，可以计算出甲基化DNA 样本在总样本中含量。

BioTNT MS- real time PCR 技术服务：设计MS-real time PCR 引物；合成；预实验；

计算样本中的甲基化含量。

 BioTNT 技术服务部提供MSP-QPCR实验解决方案：

1、您的样本可以是全血、血浆、血清、细胞或者组织；

2、采用专为亚硫酸盐转化提供佳质量的基因组DNA的抽提试剂盒，为您提取高质量的基因组DNA；

3、BioTNT 技术部丰富的实验经验为您进行亚硫酸盐的转化；

4、客户提供引物M 引物和U引物，或者由BioTNT 设计引物M引物和U引物；

5. 客户提供样本以及阳性对照和阴性对照，用相应引物进行实验；

6、好的MSP 引物（M 一对，U一对），进行real time PCR 实验；

7、MSP 引物，可以进行大批量实验，计算样本中的甲基化样本含量；

方法的局限性：部分位点由于序列的原因，难以设计合适的MSP 引物；

2.3    亚硫酸盐处理+高清溶解曲线检测

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。

可以通过峰面积计算甲基化和非甲基化的比例；

方法优点：适用于大批量实验；

方法局限性：比例的计算比较难，只适用于初步估计；