引物参数
配套试剂
订购指南
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货 号
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组 成
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目录价格 |
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QRP108000000
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目的mRNA引物（500T）
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￥168 |
QRP108000000C2
说明书下载
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Preci® rat(大鼠) Bola2l2 (基因ID：108000000) qPCR引物对 (全名：bolA family member 2 like 2；别名：) qPCR检测试剂盒 mRNA检测试剂盒，包括：目的mRNA引物（500T）、actb 内参引物（500T）、GAPDH内参引物（500T）和1ml（100T） premix （推荐！）
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￥336
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A2010A011
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Realtime PCR PreMIX 1ml （低ROX）
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￥168
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A2010A011X5
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Realtime PCR PreMIX 5ml （低ROX）
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￥596 |
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A2010A012
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Realtime PCR PreMIX 1ml （高ROX）
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￥168
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A2010A012X5
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Realtime PCR PreMIX 5ml （高ROX）
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￥596
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使用说明
mRNA qRT-PCR Sybgreen Detection Kit
Cat. A2010A0001 Size：100T
Contents and Storage（组分及贮存）
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荧光定量PCR PreMIX（染料法）
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1 mL/vial
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-20℃
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目的基因上游引物
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200 μL 10 μM
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-20℃
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目的基因下游引物
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200 μL 10 μM
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-20℃
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GAPDH上游引物
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200 μL 10 μM
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-20℃
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GAPDH下游引物
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200 μL 10 μM
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-20℃
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ACTB上游引物
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200 μL 10 μM
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-20℃
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ACTB下游引物
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200 μL 10 μM
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-20℃
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DEPC水
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1mL/vial
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-20℃
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Introduction（简介）
BioTNT 提供的mRNA qRT-PCR Sybgreen Detection Kit，包括了目的基因进行qPCR实验的所有试剂；引物是BioTNT根据NCBI数据库进行设计的引物；为全转录本引物，即可以扩增这个基因的所有转录本；PCR mix 为sybgreen 法的PCR mix，并包含ROX 参比染料，并经实验验证的系统；提供GAPDH 和ACTB 引物，是种属特异性的；您的目的基因为人/大鼠/小鼠三种目的基因时，我们试剂盒中赠送内参引物。
本试剂盒用于CDNA中的目的基因检测。提供的PCR Premix足够用于100次特异性cDNA 的qPCR实验，引物量足够进行500次Real Time PCR实验。
如果PCR premix不够使用，可以咨询biotnt单独购买。
Material & Methods（材料与方法）客户自备设备和试剂
已制备的总RNA样本；
逆转录试剂盒（oligodT或者随机引物逆转录都可以适用）；
0.6mL及1.5mL Eppendorf管（无菌、无酶、RNase-free；货号A2010B0X04）；
RNase-free Tips（1000μL、200μL的枪头；货号A2010B0X09）；
移液器（200μL，1000μL）；
恒温水浴锅或金属浴，冰浴盒；
12000g冷冻离心机；
Real Time PCR仪；
使用本qPCR产品，可兼容市场上多种现有的qPCR仪器，具体适配情况如下：
对于无需ROX校正的仪器，如Roche LightCycler 480、Roche LightCycler 96、Bio-rad iCycler iQ、iQ5及CFX96等，请在实验设置时，将passive reference选择为“None”。
针对需要Low ROX校正的仪器，包括ABI Prism7500/7500 Fast、QuantStudio 3 System、QuantStudio 5 System、QuantStudio 6 Flex System、QuantStudio 7 Flex System、ViiA 7 system、Stratagene Mx3000/Mx3005P以及Corbett Rotor Gene 3000等，请在实验分析阶段，将passive reference设定为“ROX”。
注意：若您使用的仪器属于需要High ROX校正的类型，例如ABI Prism7000/7300/7700/7900、Eppendorf以及ABI Step One/Step One Plus等，请与biotnt联系。我们将免费提供ROX染料以及相应的操作步骤，以确保您的实验顺利进行。
产品使用限制
本产品只用于分子生物学研究。其不应用于诊断、预防和治疗疾病。在使用本产品时应遵从相应的注意事项；
本产品中部分试剂有腐蚀性或毒性，勿直接接触皮肤或吞咽；
3. 操作时请穿戴实验服和手套，如接触皮肤，应立即用大量清水冲洗；
4. 误食或其他危急情况，请及时到医院就治；
5. 部分试剂易燃，请注意消防安全。
实验原理
使用BioTNT mRNA Real Time PCR assay, 采用的是两步法RT-PCR；
第一步逆转录：使用普通试剂盒中提供进行逆转录，得到CDNA；
第二步Real Time PCR：请使用本试剂盒中提供的特异性引物，以及Real Time PCR 染料法Premix；
3. 预实验进行3-5个样本的内参测试，一般内参的CT值如果高于25，建议这个样本不要使用，应该重新制备样本； 比较actb 内参和GAPDH内参的CT值，计算SD；选择SD比较小的内参基因进行正式实验；预实验可以单孔来确认；
操作说明
cDNA产物应置于-20℃保存。
Real Time PCR实验
请按照下表准备PCR体系并加入PCR反应管或96孔板：
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反应液体系
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20μL体系
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终浓度
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RNase-free Water（水）
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补足至20μL
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——
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荧光定量PCR PreMIX (2X)
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10μL
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1X
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上游引物（10μM）
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0.4μL
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0.25μM
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下游引物（10μM）
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0.4μL
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0.25μM
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cDNA
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0.5-4μL
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（1.1）为了增加实验加样的准确性，并降低工作量，推荐进行样本和引物预混，两次加样法：
计算需要加样的孔数，如果要进行三重复1个样本，20μL体系，需要3孔+1孔（阴性对照）；按照5孔的量来进行预配，取2ul目的上游引物+2ul 目的下游引物+50ul PCR PreMIX ，配制成目的引物mix 工作液；2ul内参上游引物+2ul内参下游引物+50ul PCR PreMIX ，配制成内参引物mix 工作液；
（1.2） 把CDNA根据浓度进行预稀释；每个样本可以再加水进行混合（CDNA+ 水）总体积为9.2 ul 1个样本；1个样本做三个目的加三个内参，共配制6孔；按照所需量配制CDNA预混液；剩余cDNA放回冰箱冷冻保存；
举例：CDNA 如果含量很浓，可以先预稀释后再使用；比如稀释10倍或者100倍；如果含量比较少，建议直接原倍上。最多上样量可以每孔4ul，剩余每孔的5.2ul 用水补足。根据之前的核酸定量确定稀释比例，以及上样比例。建议6孔的样本重复，可以配制7孔，正常的就是1ul CDNA+8.2ul的水的比例，配制7份（三重复目的+内参）；
（1.3） 正式实验在板上设置双重复或者三重复；根据您要检测的样本数量，在板上设置板孔；
下图为三重复的设置所示：
1个孔中加入10.8ul的引物mix 混合物，然后再加入9.2ul的cDNA工作液；
将配好体系的PCR反应管或96孔板放入Real Time PCR仪，并按照下表设置PCR反应条件：
* 本mix 采用的是化学法修饰的hot start酶，必须有95℃ 5分钟这一步，否则会导致后面的反应不能进行，没有信号检测出；
Thermofisher 仪器设置示例：
注意（非常重要）：请在Plate 选择界面，passive reference 选择 ROX；
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操作步骤
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反应条件
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温度
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时间
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预变性*
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95℃
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5 minutes
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40个循环
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变性
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95℃
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5 seconds
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退火
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60℃
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30 seconds
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延伸
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熔解曲线
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变性
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95℃
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15 seconds
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退火
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72℃
升温0.3℃
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10 seconds
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变性
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95℃
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15 seconds
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hold
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4℃
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hold
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数据分析：
质量控制：请看目的基因和内参基因的扩增曲线和熔解曲线，熔解曲线应该为78-87度的一个单峰曲线；我们提供另外一份打印说明，注明了目的基因产物和内参基因产物熔解曲线的预测TM，您实验结果的熔解曲线TM值与预测TM值应该不要相差超过2度；
数据计算：导出原始数据CT值； 计算样本的delta CT（同一样本的目的CT值减去内参的CT值），如果做了重复，请先取均值，再相减；
该样本的含量为2 -delta CT；本实验采用的数据分析方法为2-△△CT；
内参的CT值应该在15-25之间，如果内参CT低于15，建议样本稀释后再检测；如果内参CT大于25，目的基因可能会含量比较低；建议检查一下抽提和逆转录步骤，有必要的情况下建议重新制备样本；
如果内参CT值比较正常，目的CT值比较大，大于33，可能样本中目的基因的丰度比较低，可以推荐购买biotnt的阳性质控进行体系验证；或者用目的基因的下游引物进行特异性逆转录进行实验；
样本目的CT不能检测时，如果要进行计算，CT值可以计为38。
参考文献：
Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-△△CT Method，Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen，Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and† Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy，Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534
Murphy, L. D., Herzog, C. E., Rudick, J. B., Fojo, A. T., and Bates, S. E. (1990) Biochemistry 29, 10351–10356.
Noonan, K. E., Beck, C., Holzmayer, T. A., Chin, J. E., Wunder,J. S., Andrulis, I. L., Gazdar, A. F., Willman, C. L., Griffith, B.,Von-Hoff, D. D., and Robinson, I. B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. to a linear form using 2 2 C T more accurately depicts the USA 87, 7160–7164.
Horikoshi, T., et al. (1992) Cancer Res. 52, 108–116.
Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., and Williams, P. M. (1996) Genome Res. 6, 986–994.
Winer, J., Jung, C. K., Shackel, I., and Williams, P. M. (1999) Anal. Biochem. 270, 41–9.
Schmittgen, T. D., Zakrajsek, B. A., Mills, A. G., Gorn, V., Singer, M. J., and Reed, M. W. (2000) Anal. Biochem. 285, 194–204.
Schmittgen, T. D., and Zakrajsek, B. A. (2000) J. Biochem. Biophys.Methods 46, 69–81.
Chen, C. Y., and Shyu, A. B. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 8471–8482.
Iyer, V. R., et al. (1999) Science 283, 83–87.
技术支持
有关技术支持和更多信息，请浏览www.biotnt.com的网页或致电BioTNT的技术支持部门。
相关产品可以购买：
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品 名
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货号
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规格
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极速 RNA 提取试剂盒（细胞，组织）
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A2010A110
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50T
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TRIZol® RNA提取试剂盒(组织、细胞)
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A2040A401
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50T
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cDNA第一链合成/RNA逆转录试剂盒
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A2010A0601
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10ul*100T
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PCR Positive Control
(BALB/c小鼠核酸通用PCR阳性模板)
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A2010A0201
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10ul
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PCR Positive Control
(SD大鼠核酸通用PCR阳性模板)
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A2010A0301
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10ul
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Realtime PCR PreMIX(eva染料法)
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A2010A001
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1ml , 5ml
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Realtime PCR PreMIX（低ROX sybgreen)
（适用低ROX和无ROX仪器）
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A2010A011
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1ml , 5ml
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Realtime PCR PreMIX
（高ROX sybgreen）
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A2010A012
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1ml , 5ml
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