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BioTNT 甲基化检测技术服务

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      DNA突变会导致表型改变。然而,序列不变化,基因调控照样能发生,这就是表观遗传学的威力。DNA甲基化是表观遗传学中的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育中起着重要作用,也与多种癌症密切相关。

  脊椎动物的DNA甲基化通常发生在CpG岛中的胞嘧啶。CpG岛是CpG二核苷富集区域,GC含量大于50%,长约200-500 bp。甲基化是由DNA甲基转移酶所催化的,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(5mC)。这样一个简单的生化反应却有着意想不到的严重后果。许多重要的过程如胚胎发育和细胞周期调控都与甲基化息息相关,而多个癌症也表现出异常的甲基化模式。甲基化的存在就像一个开关,在不需要基因表达的时候将基因的活性关闭;去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

5-羟甲基胞嘧啶5-hydroxymethylcytosine(5-hmc)的分子式是C5H7N3O2,是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)的羟基化形式,5-羟甲基胞嘧啶是TET家族的酶通过氧化5-甲基胞嘧啶(5-mC)产生的,被称为“第六种碱基”,可以调控基因表达的关闭,是一种重要的表观遗传修饰,可能与去甲基化过程有关,5-羟甲基胞嘧啶的具体作用机制还不明确。

甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰,调节基因的表达和关闭,与癌症衰老老年痴呆等许多疾病密切相关,是表观遗传学的重要研究内容之一。 最常见的甲基化修饰有DNA甲基化组蛋白甲基化。

由于普遍认为DNA甲基化在多种疾病尤其是癌症中扮演着重要的角色,所以人们对表观遗传学研究寄予厚望,希望能从中发现新的诊断和治疗的生物标志物。

 

DNA甲基化研究有以下两大类实验路线,BioTNT 对此进行了以下比较:

 

前期处理

是否可定量

适用性

引物设计难度

数据表示

甲基化敏感性限制性酶切+QPCR

酶切

中等样本+CPG

柱状图和数值

5-hmc+5-mc 酶切+QPCR

酶切

中等样本+CPG

柱状图和数值

亚硫酸盐测序

亚硫酸盐处理

少量样本

测序报告,克隆统计

MSP+QPCR

亚硫酸盐处理

大批量样本

扩增图片或数值

HRM

亚硫酸盐处理

半定量

大批量样本

数据

 

第一类: 不进行亚硫酸盐处理,对样本进行酶切;

实验方法:采用样本抽提DNA 后,应用位点特异的甲基化酶和非甲基化酶进行样本的剪切,避免了亚硫酸盐处理;

后期采用QPCR 方式,对CPG 岛进行定量检测;

可以得到甲基化和非甲基化的含量比例;主要适用于少量样本,多位点的检测;

 

运用不同试剂盒,通过后期实时 PCR 数据用于确定 5-羟甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的数量。结果显示了所选组织中 5-羟甲基胞嘧啶水平的变化。

代表产品: Qiagen 甲基化PCR Array;

NEB 5-hmc 和5-mc 定量检测;

Biotnt 提供您进行甲基化CPG 岛甲基化含量和非甲基化含量检测的技术服务;

收费情况如下:

1. 样本抽提和处理费用,300元/样本;

2.单个CPG 岛,费用为150元/八孔双复数据;

 

新方法推荐:

不进行亚硫酸盐处理,对样本进行酶切,采用样本抽提DNA 后,应用位点特异的甲基化酶和 非甲基化酶进行样本的剪切,避免了亚硫酸盐处理;

后期采用QPCR 方式,对CPG 岛进行定量检测;

可以得到甲基化和非甲基化的含量比例;主要适用于少量样本,多位点的检测;

第一种方法,运用不同试剂盒,通过前期不同酶的处理,以及后期实时 PCR 数据用于确定 5-羟甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的数量。结果显示了所选组织中 5-羟甲基胞嘧啶水平的变化。

 

第一种:限制性酶切产物+QPCR 分析甲基化和非甲基化水平:

推荐一:采用Qiagen  EpiTect Methyl II DNA Restriction Kit (12)试剂盒,可以通过准备您的基因组DNA 样本,进行后期的QPCR;

使用试剂盒中提供的消化液,进行4种消化;methylation-sensitive restriction enzyme (Enzyme A),消化的是甲基化位点;methylation-dependent restriction enzyme (Enzyme B) 消化的是非甲基化的DNA 序列;

推荐二:采用Biotnt 甲基化DNA 限制性酶切试剂盒,可以通过准备您的基因组DNA样本, 进行后期的QPCR;

通过检测(M0, Mu, Mm,Mum)的CT 值,可以计算出M% 和U%。

 

http://www.oriongenomics.com/images/tech-ca-clinical-assays.gif

 

第二种:独特方法!

可以同时检测5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)5-甲基胞嘧啶(5-mC)的实验方法:

采用5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒,能对特定 DNA 位点内的 5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)和 5-甲基胞嘧啶(5-mC)进行定性及定量。这种酶学方法包括三步简单操作,利用了同裂酶 MspI 和 HpaII 对甲基化敏感性的不同。

简述三步操作如下:基因组 DNA 用 T4 噬菌体β-葡糖基转移酶和 UDP-葡萄糖处理,将所有的 5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)糖基化;用限制性内切酶 MspI 和 HpaII 消化 DNA,这两个同裂酶有不同的甲基化敏感性;然后用终点或实时 PCR 来定性和定量不同的甲基化状态。试剂盒的设计目的是简化甲基化分析,增加发现新生物靶标的可能性。

特性

定量分析基因座内的5-hmC 5-mC,重复性好

简单明了的实验步骤

与现有 PCR 技术相兼容

可用于高通量用户

 

http://www.neb-china.com/userfiles/E3317-2.png

5-hmC 5-mC 分析试剂盒分析 Balb/C 小鼠组织样品(基因座 12)不同的甲基化状态。A)用于甲基化分析的 6 个不同反应的终点 PCR。虚线框中的泳道显示了 5-羟甲基胞嘧啶的存在。B)实时 PCR 数据用于确定 5-羟甲基胞嘧啶和 5-甲基胞嘧啶的数量。结果显示了所选组织中 5-羟甲基胞嘧啶水平的 

实验方法和实验步骤:

1. 抽提DNA试剂盒;

2. 5-hmc 和5-mc 的处理试剂盒, 原理: 同一份样本分成三份, 按照说明, 5-hmc 可进行糖基化; 甲基化敏感的限制性内切酶进行剪切;甲基化不敏感的限制性内切酶进行剪切; 经过这个步骤,后期样本进行QPCR 检测 ; 每个样本处理费用为300元;8个样本起做;

1个CPG 岛实验费用为1500元 8个样本;

 

实验步骤:

1.  样本的基因组DNA 抽提;

2.  1份样本分成三份,进行不同的酶切处理;

3.  您要检测的基因CPG 岛查询; 1个CPG 岛 设计一对引物, 每份样本进行QPCR双重复扩增; 

4. 正式实验: 每个样本,抽提,酶切处理,1个CPG 岛的QPCR, 为样本分为四份的实验方法, 双重复实验(共8孔);样本前期试剂费用为300元/样;1个CPG 岛的检测费用为150元/样本;同一份样本,要增加一个CPG 岛,每个样本增加150元/样本;

 

实验结果显示方式:

样本

5-hmc 含量百分比;

5-mc 含量百分比;

UM(未甲基化)含量百分比;

 

 

第二类:亚硫酸盐处理后进行后期的检测分析:

样本的采集和稳定,基因组DNA 纯化,亚硫酸氢盐转化及CpG位点的甲基化检测。

后期检测分为:

1.  亚硫酸盐测序;

2.  MSP(甲基化PCR)检测;

3.  高清溶解曲线

 

2.1    亚硫酸盐测序:

实验步骤:

l  基因组DNA的提取;

l  BSP实验亚硫酸盐处理及纯化(QIAGENcat59824

l  引物的设计加粗斜体下划线部分为引物位置,红色字体区域为检测区域)PCR产物

l  PCR扩增;反应程序

l  T/A克隆与测序:PCR产物纯化,连接T载体,转化酶切法鉴定阳性菌落,挑取质粒送测序(10个克隆);

l  实验结果:

1. DNA 质量鉴定,Nano 数据,

2. DNA 完整性电泳图片;

B119-DNA

3.PCR 产物电泳图片;

 

 

 

 

4.测序分析结果:

 

2.2    特异位点的甲基化PCR(MSP)

   2.1采用基因组DNA 提取试剂盒,抽提基因组DNA;

2.2采用硫化处理试剂盒:epigentek,对样本进行硫化处理 ;

2.3 后期采用QPCR 方式或者电泳方式进行产物的检测;

  

甲基化特异性PCR(MS-PCR)

 这种方法经济实用,是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后,即可开展MS-PCR 或者MS-real time PCR。MSP方法中,通常设计 两对引物,一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板,而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段,则说明该检测位点存在甲基化,若第二对引物能扩增出片段,则说明该检测位点不存在甲基化。MS- Real time PCR与上面的原理相同,设计的引物,进行real time PCR 检测,通过CT值,扩增曲线和溶解曲线进行实验结果的判断;

如果样本中同时存在甲基化 和非甲基化的DNA 模版,则通过CT 值 和Delta CT 值,可以计算出甲基化DNA 样本在总样本中含量。

BioTNT MS- real time PCR 技术服务:设计MS-real time PCR 引物;合成;预实验;

计算样本中的甲基化含量。

 BioTNT 技术服务部提供MSP-QPCR实验解决方案:

1、您的样本可以是全血、血浆、血清、细胞或者组织;

2、采用专为亚硫酸盐转化提供最佳质量的基因组DNA的抽提试剂盒,为您提取高质量的基因组DNA;

3、BioTNT 技术部丰富的实验经验为您进行亚硫酸盐的转化;

4、客户提供引物M 引物和U引物,或者由BioTNT 设计引物M引物和U引物;

5. 客户提供样本以及阳性对照和阴性对照,用相应引物进行实验;

6、好的MSP 引物(M 一对,U一对),进行real time PCR 实验;

7、MSP 引物,可以进行大批量实验,计算样本中的甲基化样本含量;

 

方法的局限性:部分位点由于序列的原因,难以设计合适的MSP 引物;

 

2.3    亚硫酸盐处理+高清溶解曲线检测

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。

可以通过峰面积计算甲基化和非甲基化的比例;

方法优点:适用于大批量实验;

方法局限性:比例的计算比较难,只适用于初步估计;

 

技术支持:[email protected]    产品咨询:[email protected]    售后服务群:47468567
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