产品参数
小鼠白介素17A酶联免疫试剂盒
Mouse IL-17A ELISA Kit
用于血清,血浆,细胞上清及其他生物体液中
小鼠白介素17A的检测
货号: A1010A0217
96 tests
仅供科研使用,勿用于药物、临床检测
检测原理:
本试剂盒采用双抗夹心法。用抗Mouse IL-17A抗体包被于酶标板上,标准品和样本中的Mouse IL-17A与单抗结合,加入生物素化的抗Mouse IL-17A,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液,在450nm处测OD值,Mouse IL-17A浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中Mouse IL-17A的浓度。
试剂盒组份(2-8℃保存)
1. Mouse IL-17A 酶标板(coated wells),12*8wells(单孔可折),1 plate;
2. Mouse IL-17A 标准品10 ng(standards),2 vial;
3. Mouse IL-17A 120×生物素化二抗(Biotinylated Antibody),100μL,1 vial;
4. Mouse IL-17A 300×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物(Streptavidin HRP Conjugate),100μL,1 vial;
5. 稀释液I(Assay Diluent I),30 mL,1 vial;
6. 稀释液 II(Assay Diluent II),12 mL,1 vial;
7. 稀释液 III(Assay Diluent III),12 mL,1 vial;
8. 20×浓缩洗涤液(Wash Buffer),30 mL,1 vial;
9. 显色液A(Color Reagent A),6 mL,1 vial;
10. 显色液B(Color Reagent B),6 mL,1 vial;
11. 终止液(Stop Solution),12 mL,1 vial;
12. 封板膜,3张;
未提供的试剂、仪器和耗材:
1. 单道或多道(8道或12道)移液器及移液器枪头:10-200μL和50-1000μL;
2. 多道(8道或12道)移液器试剂存放槽;
3. EP管及试剂配置容器;
4. 圆柱形量筒:100mL,200mL,500mL和1L;
5. 可在450nm处进行读数的酶标仪; 洗瓶或自动洗板机;
6. 蒸馏水或去离子水;封板膜或板盖;乳胶手套;吸水纸;
注意事项:
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。
8. 标准孔及待测样本均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线,请合理安排预实验。
9. 不能使用过期产品。
样本与试剂准备:
1. 样本:本试剂盒可检测血清,血浆(EDTA,肝素抗凝),细胞培养上清液,组织匀浆等生物学样本。样本储存要求2-8℃保存48小时以内,更长时间需冷冻(-20℃或-80℃)保存,避免反复冻融。如样本Mouse IL-17A 含量过高,可用稀释液 I进行稀释。
2. 标准品配制:将10ng标准品离心后,加入1000μL的稀释液 I配制成浓度为10ng/mL的标准品溶液,轻轻振荡混匀。取490μL稀释液 I到空EP管中, 加入10μL浓度为10ng/mL的标准品,混匀,配成浓度为200pg/mL的标准品溶液(标准曲线最高点);再准备六支EP管,分别加入200μL稀释液I,吸取200pg/mL的标准品溶液200μL加入第一管中,充分混匀,从第一管中取200μL加到第二管中,充分混匀,如此反复对半稀释至浓度3.13pg/mL的标准品溶液;另取一空白EP管加入足量的稀释液I,设为空白对照。
![](file:///C:/Users/Administrator/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg)
3. 1×Biotinylated Antibody:用稀释液 II按1:120倍稀释120×生物素化二抗。
4. 1×Streptavidin-HRP Conjugate:用稀释液 III按1:300倍稀释300×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物。
5. 显色液配制:A液和B液做1:1配制,即配即用,可根据使用量临时配制(使用前15分钟内配制),不要配制过多的显色液。
6. 1×洗涤液配制:用蒸馏水1:20倍稀释(示例:1mL 20×浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水);
操作步骤:
样本,细胞上清,细胞裂解液,脑脊液,以及其他生物学样本均需要在正式实验前预实验确认稀释倍数;血清样本一般情况下建议按照50μL 上样。
酶标板是12*8wells的lockwell 形式,属于单孔可折形式,可以按照自己的需要每次拆下相应的板条来进行实验;如果第一次使用biotnt的这款试剂盒,建议您在进行大批量实验之前先进行预实验;
预实验方式:选用1条酶标板,加入标准品2000pg/ml ,8.2pg/ml,0孔;另外,再选择您待测的两个样本,第一个样本选择三个稀释梯度;第二个样本选择两个稀释梯度来进行预实验;
实验步骤:
1. 加样:加入相对应标准品100μL,加入待测样品50μL、稀释液I 50ul(样本已经稀释2倍回归计算时需乘以稀释倍数2), 封板,充分混匀,室温温育120分钟;
2. 洗板:用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次,在吸水纸上拍干;
3. 每孔加入已稀释1× Biotinylated Antibody 100μL,封板,室温温育60分钟;
4. 洗板:同第二步;
5. 每孔加1×Streptavidin- HRP 100μL,封板,室温温育60分钟;
6. 洗板:同第二步;
7. 每孔加入已配制的显色工作液100μL,将反应板置暗处室温5-15分钟,每隔一段时间,目测标准品和样本的板孔变为蓝色, 酶标仪620-630nm 进行读数并保存(第一次数据),标准品孔的最高点读数OD 值如果超过0.8,请及早终止。如果标准品最高点读数没有超过0.4,可以延长室温温育时间为30min,再进行下一步终止反应。
8. 每孔加入100μL终止液,混匀;如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。
9. 在5分钟内进行酶标仪读数,设置双波读数(第二次数据),酶标仪主波长450nm,副波长620-630nm检测吸光度。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去 620-630 nm 的测定值。仅使用450 nm 测定会导致OD值偏高,并且准确度降低。
10. 如果酶标仪没有620-630nm的波长,也可以根据酶标仪的情况选择570-650nm的波长作为替代。
结果计算与判断:
1. 所有OD值都应减除空白值后再计算;先计算450-630nm的数据(第二次数据);
2. 以标准品200,100,50,25,12.5,6.25,3.13,0pg/mL为横坐标,450-630nm的OD值为纵坐标,画出标准曲线。
3. 根据样本OD值在该曲线图上查出相对应Mouse IL-17A含量,如样本有稀释,请再乘上稀释倍数。如果样本没有进行预稀释,则稀释倍数为2 。计算出的数值应该乘以2。
4. 推荐采用双对数方式进行数据拟合。如下是示例数据:
Standard (pg/mL)
|
O.D. (450 nm-630nm)
|
Mean
|
Zero Standard Subtracted (Std.)-(S1)
|
200pg/ml
|
1.94,1.946
|
1.943
|
1.916
|
100pg/ml
|
0.983,0.986
|
0.985
|
0.958
|
50pg/ml
|
0.536,0.542
|
0.539
|
0.512
|
25pg/ml
|
0.3,0.307
|
0.304
|
0.277
|
12.5pg/ml
|
0.184,0.19
|
0.187
|
0.160
|
6.25pg/ml
|
0.111,0.119
|
0.115
|
0.088
|
3.125pg/ml
|
0.071,0.076
|
0.074
|
0.047
|
0pg/ml
|
0.026,0.027
|
0.027
|
0.000
|
![](file:///C:/Users/Administrator/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image004.jpg)
Mouse IL-17A标准曲线(pg/mL)
试剂盒数据批内差(Intra-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在同一次验证实验中加样20孔,来验证批内差,检测结果如下:
Sample
|
1
|
2
|
3
|
N
|
20
|
20
|
20
|
Mean (pg/mL)
|
7.05
|
67.45
|
133.67
|
SD(pg/mL)
|
0.37
|
3.8
|
4.46
|
CV (%)
|
5.19
|
5.64
|
3.34
|
试剂盒数据批间差(Inter-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在10次不同的实验中进行检测,来验证批间差,检测结果如下:
Sample
|
1
|
2
|
3
|
N
|
10
|
10
|
10
|
Mean (pg/mL)
|
7.7
|
70.55
|
136.71
|
SD(pg/mL)
|
0.64
|
5.58
|
7.46
|
C V (%)
|
8.31
|
7.91
|
5.46
|
试剂盒灵敏度(Sensitivity):
本试剂盒检测Mouse IL-17A的最低浓度为1.04pg/mL,验证实验选取两条标准品进行梯度稀释确认1.04pg/mL以上浓度的反应孔OD值呈正相关线性分布,Mouse IL-17A浓度在1.04-3.125pg/ml之间样本可以被检测到但会有较大偏差,低于1.04pg/mL无法被检出。
试剂盒数据回归性(Recovery):
选取血清、血浆、细胞上清等不同类型的人样本按低浓度、中浓度、高浓度分组稀释做回归性验证实验,将线性回归后的浓度值与理论浓度值相比较统计结果如下:
样本类型
|
Average Recovery%
|
范围%
|
血清
|
106
|
104-108
|
血浆
|
98
|
90-106
|
细胞上清
|
103
|
100-106
|