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Pre-miRNA 和pri-miRNA的序列查找,引物设计和实验方案推荐
BioTNT 的引物设计验证服务
(一)序列查找;
ncbi 查找Pre-miRNA序列;
而pri-miRNA 的序列呢,则是pre 序列的扩展序列;
这是右侧的序列起始,我们可以根据这个序列,向上和向下进行扩展(先各扩展50bp);
扩展后得到的就是pri microRNA 的序列;
(二)引物设计:
根据这个序列,就要进行设计了;当然这个序列的设计也是有技巧的,最重要的原则是:Pre 和Pri 要能够区分;
引物Pri 序列中是包含Pre 序列的,所以我们设计时,总不能Pri 的序列设计出来, Pre 的序列也能扩出来;
所以我们把Pri 序列分为3个部分,分别为1(5‘端扩展序列),2(pre 序列),3(3‘端扩展序列);所以,上游引物的位置和下游引物的位置,这几种搭配是可以的:
1+2;2+3;1+3;
引物设计还应该符合qPCR 的其他原则,如引物长度,产物长度,TM 值,退火温度;引物二级结构良好等特点,在oligo软件中进行引物结构分析;
(三)引物特异性比对:
请选用同种属的基因组序列对引物进行特异性比对;良好的引物应该符合特异性要求;
(四)引物合成验证:
引物采用Page 纯化,合成后引物应该进行qPCR 实验验证,模板采用基因组DNA 的模板进行验证,得到的产物扩增曲线S 型,熔解曲线单峰,且TM 与引物设计的TM 值相差不超过2度;
(五)提供产品:
提供两支引物,上下游,浓度为10um,体积为200ul,采用标准的qPCR 两步退火方式;可以进行500T的检测;
客户需要准备的:
(一)样本是否需要去除基因组:
由于pre-miRNA的序列和pri-miRNA 序列都可以在基因组上找到,所以如果想要得到准确的表达结果,样本中应该进行基因组的去除处理,可以在抽提的时候进行基因组去除,也可以在逆转录的时候进行基因组去除;
(二)RNA抽提方法:
尽量采用抽提总RNA 方法进行抽提;这个和microRNA 不同,microRNA 可以采用专门抽提的方式或者总RNA 抽提方式,不能采用仅使用mRNA的抽提方式;
(三)逆转录方式:
当然,如果要检测Pre-miRNA,由于序列不存在poly A 尾,所以在抽提了RNA, 进行逆转录时,请选择用随机引物逆转录,或者用特异性引物进行逆转录;
pri-miRNA 的逆转录方式,也是同上面的;
所以,抽提的RNA,用mRNA 的oligodT+随机引物的逆转录方式,也是可以检测PremicroRNA 和PrimicroRNA的;
这个和microRNA 的检测采用茎环法逆转录也是不同的;
(四)内参选择:
根据抽提的方式和样本的情况,如果是抽提总RNA的,可以用GAPDH,actb作为内参。