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BioTNT pri-miRNA 引物定制
    产品中心    >>  试剂    >>  分子生物学试剂    >>  PCR引物定制 关   闭
pri-miRNA 引物定制
分类:PCR引物定制
品牌:BioTNT
货号:cust-pri
原价:询价
现价:¥    节省:¥Label
特异性种属:human(人) / mouse(小鼠) / rat(大鼠)
类型:pri-miRNA 引物定制
规格:500T
产地:BioTNT
产品参数

 Pre-miRNA pri-miRNA的序列查找,引物设计和实验方案推荐

 

BioTNT 的引物设计验证服务

(一)序列查找;

ncbi 查找Pre-miRNA序列;

pri-miRNA 的序列呢,则是pre 序列的扩展序列;

这是右侧的序列起始,我们可以根据这个序列,向上和向下进行扩展(先各扩展50bp);

扩展后得到的就是pri microRNA 的序列;

(二)引物设计:

根据这个序列,就要进行设计了;当然这个序列的设计也是有技巧的,最重要的原则是:Pre Pri 要能够区分;

引物Pri 序列中是包含Pre 序列的,所以我们设计时,总不能Pri 的序列设计出来, Pre 的序列也能扩出来;

所以我们把Pri 序列分为3个部分,分别为15‘端扩展序列),2pre 序列),33‘端扩展序列);所以,上游引物的位置和下游引物的位置,这几种搭配是可以的:

1+22+31+3

引物设计还应该符合qPCR 的其他原则,如引物长度,产物长度,TM 值,退火温度;引物二级结构良好等特点,在oligo软件中进行引物结构分析;

(三)引物特异性比对:

请选用同种属的基因组序列对引物进行特异性比对;良好的引物应该符合特异性要求;

(四)引物合成验证:

引物采用Page 纯化,合成后引物应该进行qPCR 实验验证,模板采用基因组DNA 的模板进行验证,得到的产物扩增曲线型,熔解曲线单峰,且TM 与引物设计的TM 值相差不超过2度;

(五)提供产品:

提供两支引物,上下游,浓度为10um,体积为200ul,采用标准的qPCR 两步退火方式;可以进行500T的检测;

 

客户需要准备的:

(一)样本是否需要去除基因组:

由于pre-miRNA的序列和pri-miRNA 序列都可以在基因组上找到,所以如果想要得到准确的表达结果,样本中应该进行基因组的去除处理,可以在抽提的时候进行基因组去除,也可以在逆转录的时候进行基因组去除;

(二)RNA抽提方法:

尽量采用抽提总RNA 方法进行抽提;这个和microRNA 不同,microRNA 可以采用专门抽提的方式或者总RNA 抽提方式,不能采用仅使用mRNA的抽提方式;

(三)逆转录方式:

当然,如果要检测Pre-miRNA由于序列不存在poly A 尾,所以在抽提了RNA, 进行逆转录时,请选择用随机引物逆转录,或者用特异性引物进行逆转录;

pri-miRNA 的逆转录方式,也是同上面的;

所以,抽提的RNA,用mRNA oligodT+随机引物的逆转录方式,也是可以检测PremicroRNA PrimicroRNA的;

这个和microRNA 的检测采用茎环法逆转录也是不同的;

(四)内参选择:

根据抽提的方式和样本的情况,如果是抽提总RNA的,可以用GAPDHactb作为内参。

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