产品参数
小鼠干扰素γ酶联免疫试剂盒
Mouse IFN-γ ELISA Kit
用于血清,血浆,细胞上清及其他生物体液中
小鼠干扰素γ的检测
货号:A1010A0242
96 tests
仅供科研使用,勿用于药物、临床检测
检测原理:
本试剂盒采用双抗夹心法。用抗Mouse IFN-γ抗体包被于酶标板上,标准品和样本中的Mouse IFN-γ与单抗结合,加入生物素化的抗Mouse IFN-γ,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液,在450nm处测OD值,Mouse IFN-γ浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中Mouse IFN-γ的浓度。
试剂盒组份(2-8℃保存)
1. Mouse IFN-γ酶标板(coated wells),12*8wells(单孔可折),1 plate;
2. Mouse IFN-γ标准品20 ng(standards),2 vial;
3. Mouse IFN-γ120×生物素化二抗(Biotinylated Antibody),100μL,1 vial;
4. Mouse IFN-γ 1200×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物(Streptavidin HRP Conjugate),20μL,1 vial;
5. 稀释液I(Assay Diluent I),12 mL,1 vial;
6. 稀释液 II(Assay Diluent II),12 mL,1 vial;
7. 稀释液 III(Assay Diluent III),12 mL,1 vial;
8. 20×浓缩洗涤液(Wash Buffer),50 mL,1 vial;
9. 显色液A(Color Reagent A),6 mL,1 vial;
10. 显色液B(Color Reagent B),6 mL,1 vial;
11. 终止液(Stop Solution),12 mL,1 vial;
未提供的试剂、仪器和耗材:
1. 单道或多道(8道或12道)移液器及移液器枪头:10-200μL和50-1000μL;
2. 多道(8道或12道)移液器试剂存放槽;
3. EP管及试剂配置容器;
4. 圆柱形量筒:100mL,200mL,500mL和1L;
5. 可在450nm处进行读数的酶标仪; 洗瓶或自动洗板机;
6. 蒸馏水或去离子水;封板膜或板盖;乳胶手套;吸水纸;
注意事项:
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。
8. 标准孔及待测样本均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线,请合理安排预实验。
9. 不能使用过期产品。
样本与试剂准备:
1. 样本:本试剂盒可检测血清,血浆(EDTA,肝素抗凝),细胞培养上清液,组织匀浆等生物学样本。样本储存要求2-8℃保存48小时以内,更长时间需冷冻(-20℃或-80℃)保存,避免反复冻融。如样本Mouse IFN-γ含量过高,可用稀释液 I进行稀释。
标准品配制:将20ng标准品离心后,加入1000μL的稀释液 I配制成浓度为20ng/mL的标准品溶液,轻轻振荡混匀。取800μL稀释液 I到空EP管中, 加入200μL浓度为20ng/mL的标准品,混匀,配成浓度为4000pg/mL的标准品溶液(标准曲线最高点);再准备六支EP管,分别加入600μL稀释液I,吸取4000pg/mL的标准品溶液400μL加入第一管中,充分混匀,从第一管中取400μL加到第二管中,充分混匀,如此反复稀释至浓度16.38pg/mL的标准品溶液;另取一空白EP管加入足量的稀释液I,设为空白对照。
![](/incs/file/fckeditor/1(50).png)
1. 1×Biotinylated Antibody:用稀释液 II按1:120倍稀释120×生物素化二抗。
2. 1×Streptavidin-HRP Conjugate:用稀释液 III按1:1200倍稀释1200×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物。
3. 显色液配制:A液和B液做1:1配制,即配即用,可根据使用量临时配制(使用前15分钟内配制),不要配制过多的显色液。
4. 1×洗涤液配制:用蒸馏水1:20倍稀释(示例:1mL 20×浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水);
操作步骤:
样本,细胞上清,细胞裂解液,脑脊液,以及其他生物学样本均需要在正式实验前预实验确认稀释倍数;血清样本一般情况下建议按照50μL 上样。
酶标板是12*8wells的lockwell 形式,属于单孔可折形式,可以按照自己的需要每次拆下相应的板条来进行实验;如果第一次使用biotnt的这款试剂盒,建议您在进行大批量实验之前先进行预实验;
预实验方式:选用1条酶标板,加入标准品4000pg/ml ,16.38pg/ml,0孔;另外,再选择您待测的两个样本,第一个样本选择三个稀释梯度;第二个样本选择两个稀释梯度来进行预实验;
实验步骤:
1. 加样:加入相对应标准品,待测样品各50μL,稀释液I 50ul, 封板,充分混匀,室温温育120分钟;
2. 洗板:用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次,在吸水纸上拍干;
3. 每孔加入已稀释1× Biotinylated Antibody 100μL,封板,室温温育60分钟;
4. 洗板:同第二步;
5. 每孔加1×Streptavidin- HRP 100μL,封板,室温温育30分钟;
6. 洗板:同第二步;
7. 每孔加入已配制的显色工作液100μL,将反应板置暗处室温5-15分钟,目测标准品和样本的板孔变为蓝色, 酶标仪620-630nm 进行读数并保存(第一次数据),标准品孔的最高点读数OD 值在0.7-1.0之间,可以进行下一步终止反应;
8. 每孔加入100μL终止液,混匀;如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。
9. 在5分钟内进行酶标仪读数,设置双波读数(第二次数据),酶标仪主波长450nm,副波长620-630nm检测吸光度。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去 620-630 nm 的测定值。仅使用450 nm 测定会导致OD值偏高,并且准确度降低。
10. 如果酶标仪没有620-630nm的波长,也可以根据酶标仪的情况选择570-650nm的波长作为替代。
结果计算与判断:
1. 所有OD值都应减除空白值后再计算;先计算450-630nm的数据(第二次数据);
2. 以标准品4000,1600,640,256,102.4,40.96,16.38.,0pg/mL为横坐标,450-630nm的OD值为纵坐标,画出标准曲线。
3. 根据样本OD值在该曲线图上查出相对应Mouse IFN-γ含量,如样本有稀释,请再乘上稀释倍数。如果样本没有进行预稀释,则稀释倍数为2 。计算出的数值应该乘以2。
4. 推荐采用双对数方式进行数据拟合。如下是示例数据:
Standard (pg/mL)
|
O.D. (450 nm-630nm)
|
Mean
|
Zero Standard Subtracted (Std.)-(S1)
|
4000pg/ml
|
2.058,2.061
|
2.060
|
1.951
|
1600pg/ml
|
1.022,1.029
|
1.026
|
0.917
|
640pg/ml
|
0.406,0.413
|
0.410
|
0.301
|
256pg/ml
|
0.265,0.27
|
0.268
|
0.159
|
102.4pg/ml
|
0.174,0.176
|
0.175
|
0.066
|
40.96pg/ml
|
0.13,0.136
|
0.133
|
0.024
|
16.384pg/ml
|
0.117,0.12
|
0.119
|
0.010
|
0pg/ml
|
0.107,0.111
|
0.109
|
0.000
|
![](/incs/file/fckeditor/2(47).png)
Mouse IFN-γ标准曲线(pg/mL)
试剂盒数据批内差(Intra-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在同一次验证实验中加样20孔,来验证批内差,检测结果如下:
Sample
|
1
|
2
|
3
|
N
|
20
|
20
|
20
|
Mean (pg/mL)
|
134.33
|
1333.4
|
2667.18
|
SD(pg/mL)
|
8.74
|
60.14
|
114.96
|
CV (%)
|
6.51
|
4.51
|
4.31
|
试剂盒数据批间差(Inter-Assay):
选取不同浓度的血浆样本各3例在10次不同的实验中进行检测,来验证批间差,检测结果如下:
Sample
|
1
|
2
|
3
|
N
|
10
|
10
|
10
|
Mean (pg/mL)
|
133.8
|
1334.61
|
2669.33
|
SD(pg/mL)
|
10.08
|
82.88
|
142.28
|
CV (%)
|
7.53
|
6.21
|
5.33
|
试剂盒灵敏度(Sensitivity):
本试剂盒检测Mouse IFN-γ的最低浓度为5.46pg/mL,验证实验选取两条标准品进行梯度稀释确认5.46pg/mL以上浓度的反应孔OD值呈正相关线性分布,Mouse IFN-γ浓度在5.46-16.384pg/ml之间样本可以被检测到但会有较大偏差,低于5.46pg/mL无法被检出。
试剂盒数据回归性(Recovery):
选取血清、血浆、细胞上清等不同类型的人样本按低浓度、中浓度、高浓度分组稀释做回归性验证实验,将线性回归后的浓度值与理论浓度值相比较统计结果如下:
样本类型
|
Average Recovery%
|
范围%
|
血清
|
105
|
103-107
|
血浆
|
103
|
94-112
|
细胞上清
|
100
|
93-107
|